Fluorescencija je fizički učinak uzrokovan emisijom svjetlosne energije kada je tvar osvijetljena svjetlom ili drugim oblicima elektromagnetskog zračenja. Fluorescentna mikroskopija je optički mikroskop koji koristi fluorescenciju i fosforescenciju in situ ili u kombinaciji s refleksijom i apsorpcijom za proučavanje optičkih svojstava organskih i anorganskih objekata. Fluorescentna mikroskopija pomaže da se jasnije vide subcelularne i unutarnje strukture objekata. Početkom 20. stoljeća otkrili su ga August Köhler, Carl Reichert i Heinrich Lehmann.
Indeks članka (kliknite za skok)
Kakofluorescentna mikroskopijadjela
Rad fluorescentne mikroskopije
Komponente fluorescentnog mikroskopa
1. Fluorofor
2. Izvor svjetlosti
3. Filtar uzbude
4.Dihroično zrcalo
5. Ispusni filtar
Prednosti fluorescentne mikroskopije
Nedostaci fluorescentne mikroskopije
Primjena fluorescentne mikroskopije
Kako radi fluorescentna mikroskopija
Fluorescentna mikroskopija obično radi bojenjem sastava i strukture uzorka s bojama. To je zato što je većina staničnih komponenti u prirodi bezbojna. Stoga se ne mogu lako razlikovati jedni od drugih. Fluorofori ili fluorescentne molekule osvijetljene svjetlom kratke valne duljine ili elektromagnetskim zrakama teže emitirati svjetlost. Emitirana svjetlost ima veću valnu duljinu u usporedbi s upadnom svjetlošću. Tipično, trajanje između zračenja i emisije mjeri se u nanosekundama i može se lako zanemariti. Emitirana svjetlost je odvojena od upadne svjetlosti, što govori točnu lokaciju fluorofora. Slika uzorka generira se na temelju sekundarne svjetlosti, a ne primarne upadne svjetlosti.
Rad fluorescentne mikroskopije
Fluorescentna mikroskopija djeluje slično svjetlosnoj mikroskopiji. Sastoji se od jakog izvora svjetlosti, posebnog pojasnog filtra i fluorescentne oznake uzorka. Uzorak koji se proučava stavlja se pod mikroskop. Uzorak je osvijetljen svjetlom valne duljine koja je dovoljno kratka da pobudi fluorofor. Uz pomoć leće objektiva to se svjetlo fokusira na uzorak. Ekscitacijske zrake koje emitira uzorak zatim se fokusiraju na detektor kroz leću objektiva. Glavnina pobudne svjetlosti prolazi kroz predmet uzorka, dok se dio reflektira natrag i dolazi do detektora.
Komponente fluorescentnog mikroskopa
1. Fluorofor
Fluorofor je spoj koji emitira svjetlost kada je pobuđen elektromagnetskim ili svjetlosnim valovima. Također se naziva fluorescentna boja. Fluorofori se u osnovi sastoje od kombinacije aromatskih skupina ili ravnih/cikličkih molekula s različitim π vezama.
2. Izvor svjetlosti
Izvor svjetlosti jedna je od najvažnijih komponenti fluorescentnog mikroskopa. Ovdje najčešći izvori svjetlosti koji se koriste za pobuđivanje uključuju lasere, LED diode velike snage, ksenonske lučne žarulje, žarulje sa živinom parom itd.
3. Filtar uzbude
Ekscitacijski filtri koji se koriste u fluorescentnoj mikroskopiji obično su propusni pojasni filtri koji dopuštaju signale koji su unutar određene širine pojasa dok odbijaju sve ostale signale. Valne duljine koje apsorbira fluorofor lako prolaze, dok je reflektirano optičko zračenje blokirano.
4.Dihroično zrcalo
Dikroična zrcala djeluju kao filtri tankog filma. Primarna svrha dikroičnog zrcala je selektivno propuštanje svjetlosti malog raspona boja dok reflektira sve ostale boje. Također je poznat kao precizni filtar boja.
5. Ispusni filtar
Emisioni filtar je pojasni filtar. Filtri emisije rade slično filtrima pobude. Zrači svjetlost koju emitira fluorofor dok blokira pobudnu svjetlost.
Prednosti fluorescentne mikroskopije
1. Osjetljivost fluorescentne mikroskopije je vrlo visoka, jednaka približno 50 molekula po kubnom mikrometru.
2. Uz fluorescentnu mikroskopiju, različite molekule mogu se obojiti različitim bojama, omogućujući korisnicima da slikaju više molekula tvari u isto vrijeme.
3. Fluorescencijski mikroskopi učinkovitiji su od tradicionalnih optičkih mikroskopa.
4. Može se koristiti za in vivo i in vitro snimanje.
5. Fluorescentna mikroskopija može odvojiti pojedinačne proteine s velikom preciznošću.
6. Fluorescentna mikroskopija je najprikladnija za oslikavanje i proučavanje dinamičkog ponašanja koje pokazuju žive stanice.
7. Fluorescentna mikroskopija može proizvesti jasne slike visoke razlučivosti, čime se poboljšava istraživanje.
8. Kombinira svojstva povećanja optičke mikroskopije s vizualizacijom fluorescencije.
9. Fluorescentna mikroskopija može se koristiti za stvaranje 3D uvećanih slika uzorka koji se proučava.
Nedostaci fluorescentne mikroskopije
1. Fluorescentni spojevi ili fluorofori prisutni u fluorescentnoj mikroskopiji imaju tendenciju da izgube svoju sposobnost emitiranja svjetlosti tijekom vremena kada su pobuđeni zbog procesa koji se naziva fotoizbjeljivanje. Fotoizbjeljivanje se obično događa kada je molekula fluorofora kemijski oštećena zbog elektroničke ekscitacije tijekom fluorescencije.
2. Omogućuje samo promatranje i proučavanje određenih struktura u uzorku koje su istaknute i označene kao fluorescentne.
3. Kada su fluorescentni materijali ozračeni svjetlošću, fluorescentne molekule često proizvode kemikalije, što dodatno dovodi do fototoksičnosti. Ovaj fototoksični učinak uništava izvorna svojstva promatranog uzorka. Fototoksičnost kratkovalnog svjetlosnog zračenja je relativno visoka.
4. Fluorescentna mikroskopija ne može pružiti informacije o lipidnom dvosloju, posebno za SUV vozila.
5. Fluorescentna mikroskopija ne može dati nikakva zaključna opažanja vezana uz dvoslojni karakter ili lamelarnost vezikula.
6. Dodavanje sondi i bojila često ometa svojstva lipidnih vezikula, što dovodi do netočne interpretacije podataka i time uništava autentičnost eksperimenta.
7. Peroksidacija lipida izazvana svjetlom može dovesti do stvaranja domene.
Primjena fluorescentne mikroskopije
1. Fluorescentna mikroskopija naširoko se koristi za proučavanje unutarnje strukture uzoraka na mikroskopskoj razini s najvišom kvalitetom.
2. Fluorescentna mikroskopija je najprikladnija za proučavanje živih bioloških uzoraka.
3. Ova vrsta mikroskopa često se preferira kada se označavaju najdublje strukture stanica ili mikroorganizama.
4. Pomaže u mjerenju fiziološkog stanja stanica ili uzoraka koji se promatraju.
